<menuitem id="x5e7v"></menuitem>

<bdo id="x5e7v"><xmp id="x5e7v"><samp id="x5e7v"><ins id="x5e7v"><samp id="x5e7v"></samp></ins></samp>
<bdo id="x5e7v"><xmp id="x5e7v">
<bdo id="x5e7v"><xmp id="x5e7v">

<menuitem id="x5e7v"></menuitem>

<bdo id="x5e7v"></bdo>

返回首頁 在線留言 聯系我們

產品目錄

聯系方式

首頁 > 技術支持 > 人外周血TH1/TH2/TH17細胞流式檢測方案(佛波酯離子霉素刺激)

技術支持

人外周血TH1/TH2/TH17細胞流式檢測方案(佛波酯離子霉素刺激)
發布時間:2017-12-28   點擊次數:14250次

人外周血TH1/TH2/TH17染色

 

 

 

Tips:采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管,刺激劑盡量選用凍干粉自己配置;cocktail刺激劑是液體形式,PMA會因保存不當導致活性降低,影響刺激效果,而凍干粉形式的PMA較穩定,可以保證刺激效果。

 

人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測

 

細胞刺激:(刺激體系1ml)

取人外周血(肝素抗凝)200 ml加入24孔板內,加入800 ml的完全培養基,再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin(1mg/ml),輕輕吹打混勻細胞。放入 CO2培養箱培養刺激0.5小時后,每孔再加入2μl Brefeldin A(5mg/ml),輕輕吹打混勻細胞,放入CO2培養箱培養刺激3.5小時。

 

流式檢測:

1、收集細胞于流式管內,500 g/8min離心,槍頭吸去上清,彈散管底沉淀,加入相應的表面染色抗體(CD3\CD8),彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后,500 g/8min離心,槍頭吸去上清;

2、彈散管底沉淀,加入1ml的固定/破膜工作液,(1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization  Diluent稀釋),旋渦混勻,現配現用;

3、室溫避光孵育30分鐘, 600 g/10min離心,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清(此時細胞已在管底形成很牢固的沉淀,不容易丟 失),彈散管底沉淀;

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X,須與蒸餾水1:10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細胞,破膜15分鐘(室溫避光), 600 g/10min,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清,彈散管底沉淀;

5、加入100μl Permeabilization Buffer(1x),同時加入相應的細胞因子染色抗體,室溫避光孵育15分鐘;

6、加1ml Permeabilization Buffer(1x),600 g/ 8min;在吸水紙上倒扣流式管棄去上清;彈散管底沉淀;

7、加入適量體積(建議300~500 ml)的PBS重懸細胞,并上機檢測并分析。

 

Tips:1、根據實驗需求選擇相應的抗體,并做單染管用于調節補償(具體如何設置單染管,可參照后文中補償章節的介紹)。

     2、盡量做同型對照,因細胞因子表達量不高(尤其是IL-4表達量非常低),細胞因子抗體對應的同型對照一般都要做。

     3、PMA刺激會導致人T細胞表面CD4表達的下調,PMA與Lonomycin聯合刺激下調非常明顯,4h刺激后會下調50%以上,6h刺激幾乎檢測不到CD4,因此我們的界定CD4+T細胞是通過染CD3和CD8,來圈CD3+CD8-的細胞。

     4、PMA對小鼠T細胞CD4表達影響很小,因此可以直接染CD4來圈門。

     5、因破膜劑對細胞損傷較大,建議離心后形成的細胞沉淀先彈散形成細胞懸液,在加入破膜劑,這樣會減少對細胞的損傷(形成的細胞碎片較少)。

 

人外周血TH1/TH17染色結果

 

             

 

注意:細胞破膜后對形態影響較小,因此可以直接圈淋巴門分析,在通過圈CD3+CD8-的細胞(此處未列出圖)來分析CD4+的細胞表達細胞因子的量。因此此圖橫坐標就直接標的CD4。

 

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

 

 

品牌

產品編號

產品名稱

規格

價格

BioGems

 05111-60

 Anti-Human CD3 PE

25 test/100 tests

700元/

BioGems

 10111-50

 Anti-Human CD8a FITC

25 test/100 tests

560元/

BioGems

 80811-80

 Anti-Human IFN gamma APC

25 test/100 tests

1680元/

BioGems

 81111-77

 Anti-Human IL-4 PE-Cy7

25 test/100 tests

1890元

BioGems

 73821-60

 Anti-Human IL-17A PE

25 test/100 tests

1890元

BioGems

 44212-80-100

 Mouse IgG1 Isotype Control APC

100 mg

1750元

BioGems

 44212-77-100

Mouse IgG1 Isotype Control  PE-Cy7

100 mg 

1890元

BioGems

 44212-60-100

Mouse IgG1 Isotype Control PE

100 mg

1890元

BioGems

2031560-5mg

 Brefeldin A 布雷菲爾德菌素A

5 mg

880元

BioGems

5608212-1mg

Ionomycin (calcium salt) 離子霉素

1 mg

880元

BioGems

1652981-1mg

Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA 佛波酯

1 mg

880元

BioGems

92110-00-150

Permeabilization Buffer (10X)

150 ml

1030元

BioGems

92160-00-160

Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent

160 ml

420元

BioGems

92550-00-50

Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate

50 ml

1050元

 

流式方案BioGems*資料。

 

背景知識

 

TH1/TH2/TH17細胞[3]

Th細胞是適應性免疫應答主要參與者。傳統觀念根據Th細胞分泌的細胞因子不同將其分為兩型:一型能產生IFN-г的Th1細胞,在介導細胞免疫應答中起重要作用;另一型能產生IL-4的Th2細胞,它們與體液免疫應答有關。Th1/Th2細胞由共同前體細胞即CD4+T細胞分化而來,CD4+T細胞活化后,在IL-l2的作用下向Thl細胞分化。IL-l2是CD4+T細胞分化為Th1細胞的決定因子。IL-l2與IL-12R結合后誘導信號轉導和STAT4分子的活化,可上調IFN-г,進而活化STAT1分子,并誘導Th1細胞分化特異性地轉錄因子T-bet?;罨腃D4+T細胞在IL-4作用下向Th2細胞分化。

 

Th 17細胞是一型zui近發現的CD4+T細胞,主要分泌IL-17A(即IL-17),與炎性反應和自身免疫疾病有關?;罨腃D4+T細胞在IL- 21或IL-6與TGF-β的共同作用下,經STAT3通路激活視黃酸相關孤兒核受體(ROR)-гt和ROR-α,zui終分化為Th17細胞。

 

PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)是一種佛波酯,常用于激活某些類型的蛋白激酶C(PKC),如group A (α, βI, βII, γ) 和group B (δ, ε, η, θ)異構體。佛波酯(包括PMA)的結構類似于二?;视?,可通過與PKC的C1域相互作用而活化PKC異構體。通過PCK,PMA也活化某些MAP激酶途徑。PMA高濃度長時間作用于細胞可引起總PKC活性及其成瘤性的降低,而低濃度可能起保護作用。此外,PMA也促進造血分化。PMA的水溶性約是PDBu(phorbol-12,13-dibutyrate)的10倍,提示PMA更適合用于細胞學研究。

 

Ionomycin 離子霉素是Streptomyces conglobatus細菌生成的一種離子載體。用來提高胞內鈣離子濃度,了解鈣離子跨膜轉運機制。也可用于刺激以下胞內因子產生:干擾素,穿孔素 ,IL-2和 IL-4,一般和佛波酯聯合使用。這些細胞因子在炎癥反應中有重要作用。

 

Brefeldin A布雷菲爾德菌素A通過間接阻止COP-I與高爾基膜的連接,抑制內質網到高爾基體的蛋白質轉運。

 

引用

1 BioGems*資料

2 Wiki

3 《Th1、Th2、Th17和Treg研究現狀》 張文林

 

相關產品咨詢歡迎您致電 華雅再生醫學旗艦公司:紅榮微再(上海)生物工程技術有限公司  :1500 1904 520。紅榮微再-客服: 2395557778  經銷商專員

 

 

分享到:

返回列表 | 返回頂部
上一篇 : 人間充質干細胞流式檢測方案    下一篇 :  Illumina 測序原理
網站首頁 公司簡介 產品中心 應用案例 技術支持 企業動態 聯系我們
紅榮微再(上海)生物工程技術有限公司 版權所有 總訪問量:625476
地址:上海市閔行區都莊路4226號 ??怂股虅沾髲B3幢201室
GoogleSitemap 技術支持:化工儀器網 ICP備案號:滬ICP備20015702號-1
手機:
15021010459
 

化工儀器網

推薦收藏該企業網站
老湿机69福利区无码
<menuitem id="x5e7v"></menuitem>

<bdo id="x5e7v"><xmp id="x5e7v"><samp id="x5e7v"><ins id="x5e7v"><samp id="x5e7v"></samp></ins></samp>
<bdo id="x5e7v"><xmp id="x5e7v">
<bdo id="x5e7v"><xmp id="x5e7v">

<menuitem id="x5e7v"></menuitem>

<bdo id="x5e7v"></bdo>