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技術支持

如何做好RNA提取
發布時間:2022-01-25   點擊次數:165次

如何做好RNA提取


RNA定義:

RNA作為重要的生物大分子,是生命現象的分子基礎之一。mRNA在信息傳遞中起很重要的作用ea6d18。其它兩大類RNA,rRNA和tRNA,同樣在蛋白質的生物合成中發揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現生命性狀的蛋白質的過程中舉足輕重。很多實驗中也需要提取相應樣本的RNA作為實驗原料。

 

提取方法:

   1.Trizol法異硫氰酸胍/苯酚法

TRIzol試劑有多組分分離作用,最大特點就是可同時分離一個樣品RNA/DNA/蛋白質。TRIzol使樣品勻漿化,細胞裂解,溶解細胞內含物,同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后,溶液分為水相和有機相,RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中間層可回收DNA,用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質。

   2.CTAB法


影響因素:

1.樣本材料:

●建議使用新鮮材料。切記使用反復凍融的材料。

●材料長期保存建議液氮,—80℃短期保存

2.樣本處理:

根據不同材料選擇不同的樣本處理

●培養細胞:通??芍苯蛹恿呀庖毫呀?/span>

●酵母和細菌:直接液氮研磨,之后用Trizol裂解

●動植物組織:先液氮研磨和勻漿,后加裂解液裂解。

純化方案:

●經典的沉淀方法,雖然經濟,但操作時間長,易造成 RNA 降解;

●離心柱式純化方法:抽提速度快,能有效去除影響后續RNA酶反應的雜質。

●磁珠法:同時兼具了樣本需求低、操作方便、適配全自動化等優點,目前是尤為常用的核酸純化方法。


常見問題:

1.RNA降解

●樣品取樣以及保存是否得當

●裂解液的質量

●外源RNase的污染

●裂解液的用量不足

●組織裂解不充分

●另外某些富含內源酶的樣品(如脾臟,胸腺等),很難避免RNA 的降解。

2.OD260/OD280<1.65 

●檢測吸光度時,RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低PH值條件下OD280值偏高; 

●樣品勻漿時加的試劑量太少或樣本量過多; 

●吸取水相時混入了有機相; 

●RNA沉淀未完全溶解。

3.RNA總量低

●樣本選擇問題:樣本自身豐度不足

●樣品裂解或勻漿處理不徹底;

●RNA沉淀未完全溶解。


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