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技術支持

關于外泌體培養的那些事
發布時間:2022-03-29   點擊次數:71次

什么是外泌體

簡單介紹?下細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)。細胞外囊泡是細胞以多種形式分泌到細胞外的各種囊泡:

其主要分為外泌體(Exosomes)直徑為30-150nm,以內吞的形式釋放到細胞外;微囊泡(Microvesicles)直徑為100-1000nm,以出芽的形式釋放到細胞外;凋亡?體(Apoptotic body)直徑為50-2000nm,由凋亡細胞產?。


生理功能:

外泌體是細胞與細胞間通訊中起關鍵作?的胞外基質成分,?泛參與細胞間物質運輸與信息傳遞,調控細胞?理活動;同時,外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫調節作?和誘導正常細胞轉化,促進腫瘤發?及轉移的作?;此外,外泌體還可以作為“天然的納?粒?"來進?藥物遞送,裝載的藥物類型包括?分?化學藥物、蛋?質和肽、核酸藥物等。


樣本來源:

目前外泌體研究的樣本主要是以細胞培養上清以及各種體液為主,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。


分離手段:

外泌體分離的方式方法有很多很多種,這邊就比較其相對的優劣勢進行簡單的比較:

1.差速超速離?:差速超速離?是?家最熟悉的?種分離?法,?獻中?得最多的且也是?前?較能受到認可的?法。差速超速離?是先通過低速離?去除細胞和細胞凋亡碎?,再通過超?速去除?囊泡和沉淀外泌體。此?法分離得到的外泌體可?于后續的鑒定實驗、分?檢測實驗、細胞實驗和動物實驗。

2.密度梯度離?:此?法多指蔗糖密度梯度超速離?。此?法從不同密度的顆粒中分離出囊泡,對離?的時間?較敏感。如果外泌體和顆粒密度相似,外泌體可能會被其他顆粒污染。

3.超濾:超濾過程中需要?超濾膜進?外泌體隔離。在分離過程中,外泌體可能會阻塞過濾孔,導致膜的壽命減短,分離效率較低。同時,外泌體會粘附在膜上,導致產量降低。

4.免疫磁珠法:?包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合,即可將外泌體吸附并分離出來。該?法分離得到的外泌體的?物活性易受pH和鹽濃度影響,不利于下游實驗。

5.試劑盒分離法:?前商業化的外泌體提取試劑盒多種多樣,提取效果良莠不齊。同時試劑盒本?的價格?較?,且外泌體的得率和純度?般,不是性價??的?種分離?法。


外泌體的鑒定:

外泌體分離之后,需要經過?系列鑒定才能確定分離的是外泌體。。下?介紹?種鑒定?法:

1.透射電鏡鑒定法:透射電鏡,全稱為透射電?顯微鏡(Transmission Electron Microscope,簡稱TEM),分辨率為0.1~0.2nm,適合外泌體雙層囊膜超微結構觀察,?于鑒定樣本中是否存在外泌體樣結構,即通常為茶托型或?側凹陷的半球形。

2.濃度粒徑檢測法:納?顆粒跟蹤分析法,簡稱NTA(Nanoparticle Tracking Analysis),該技術已被外泌體研究領域認可為外泌體表征?段之?。NTA技術的樣本處理簡單、能保證外泌體原始狀態、檢測速度快,檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。

3.Western Blot分?標志物檢測: WB可以?來鑒定外泌體的標志蛋?是否存在于樣本中。外泌體標志蛋?包括四跨膜蛋?家族,如CD9、CD63和CD81;細胞質蛋?,如肌動蛋?(Actin)和鈣磷脂結合蛋?(Annexins);參與?物功能的分?,如凋亡轉接基因2互作蛋?X(ALIX)、腫瘤易感基因101蛋?(TSG101)、熱休克蛋?(HSP70、HSP90),以及細胞分泌的特異性蛋?。

4.流式細胞術檢測:外泌體可以先進?熒光標記,再通過流式細胞儀檢測外泌體表?標記蛋?。但是傳統的流式細胞儀檢測樣本的顆粒??是300-500nm,?外泌體直接都在300nm以下,因此,可能?量的外泌體檢測不到,造成分析不太準確。

5.ELISA檢測:根據外泌體的表?標志物,如CD9、CD63進?ELISA實驗,來檢測外泌體的蛋?量,從?實現對外泌體的分析。但是ELISA?法容易受其他抗原的?擾,引起實驗結果出現偏差。


外泌體提取下游實驗:

1.外泌體microRNA測序/芯?:通過對外泌體microRNA的?通量分析,可以找到不同外泌體之間差異表達的microRNA,為后續的功能學實驗做準備。

2.外泌體mRNA測序/芯?:通過對外泌體轉錄組測序或表達譜芯?分析,可以找出不同外泌體之間差異表達的mRNA,從?發現外泌體中哪些基因發?了變化。

3.外泌體lncRNA芯?:通過lncRNA芯?可以同時得到lncRNA和mRNA數據,為研究者提供更完整的lncRNA和mRNA篩查。

4.外泌體ceRNA芯?:競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)機制如下:microRNA(miRNA)處在調控?絡的中?,lncRNA分?富含miRNA結合位點,可以競爭性地結合miRNA,解除miRNA對其靶基因的抑制作?,進?調控基因的表達?平。通過ceRNA芯?可以為研究者提供完整的lncRNA,circRNA和mRNA篩查。

5.外泌體蛋?質組學:主要包括iTRAQ蛋?質組定量/TMT標記定量蛋?質組學/label free蛋?質組定量。通過蛋?質組學分析,尋找差異表達蛋?,并揭?其細胞?理病理功能。


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